稀疏解卷积：实现活细胞超分辨率荧光显微成像的“新利器”
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超分辨率荧光显微成像技术在生命科学领域有着广泛的应用，但在活细胞成像时也面临着一系列挑战。北京大学陈良怡教授团队与哈尔滨工业大学李浩宇教授团队合作提出稀疏解卷积算法，克服荧光显微镜的物理分辨率极限，实现通用的分辨率提升。该算法在活细胞成像应用与实践过程中，实现了约60纳米空间分辨率的毫秒曝光或者多色、三维、长时间的超分辨率荧光显微成像，同时该算法还能与现有多数商业荧光显微镜结合应用，可谓是实现活细胞超分辨率荧光显微成像的“新利器”。
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现代科技和生物医学的交叉融合推动着临床医学的理念革新和技术进步。光学显微镜作为一种成像仪器，长期以来一直为精密制造和生命科学等领域的定性与定量分析和研究提供着有效而关键的支撑。2014年诺贝尔化学奖授予了美国科学家埃里克•贝齐格、威廉•莫纳和德国科学家斯特凡•黑尔，以表彰他们为发展超分辨率荧光显微镜所作的贡献。他们利用控制荧光分子特性的方式，克服了传统光学显微镜分辨率受限于光学衍射极限的问题，实现了“荧光超分辨”成像。借助这种新兴的生物医学影像工具，研究人员可对生物体乃至细胞内部不同结构成分及其相互作用进行观察分辨，这也使得动态记录生命活体或者活细胞中的精细结构和动态变化成为可能。
尽管超分辨率荧光显微成像在理论上具有无限的空间分辨率，但在活细胞成像中，超分辨率显微镜的空间分辨率会受限于荧光分子单位时间内发出的光子数。活细胞中快速移动的亚细胞结构（如管状内质网、脂滴、线粒体和溶酶体）在成像时会产生运动伪影，这使得空间分辨率的任何提升都需要与时间分辨率的增加相匹配。因此，现有超分辨率荧光显微成像手段大都需要依靠强照明功率（每平方毫米在千瓦至兆瓦级别）、特殊荧光探针以及长曝光时间（大于2秒），才能在活细胞上达到60纳米的空间分辨率极限。然而，强照明功率引起的强漂白会破坏真实荧光结构的完整性，长曝光时间在图像重建时会导致运动伪影，降低有效分辨率。迄今为止，基于光学硬件或者荧光探针的改进方案，都无法进一步使活细胞超分辨率荧光显微成像提升到毫秒尺度60纳米的时空分辨率。例如，非线性结构光显微镜（Structured Illumination Microscopy, SIM）虽可实现接近60纳米的空间分辨率，但需以降低时间分辨率为代价，且需使用光漂白敏感的可光活化/光开关荧光蛋白。此外，由于细胞深层内部的分辨率和对比度仍然受到荧光发射和离焦平面散射的影响，高对比度超分辨率结构光显微成像的成像深度只能被限制在0.1～1微米。因此，当前亟待找寻一种超分辨率方法，能够在活细胞中实现约60纳米空间分辨率的毫秒曝光或者进行多色、三维、长时间的超分辨率荧光显微成像。
稀疏解卷积算法
北京大学陈良怡教授团队与哈尔滨工业大学李浩宇教授团队合作，提出“荧光图像的分辨率提高等价于图像的相对稀疏性增加”这一新的超分辨率荧光显微成像的通用先验知识，再结合早前提出的信号时空连续性的先验知识，发明了两步迭代解卷积求解算法，即稀疏解卷积（Sparse Deconvolution）算法。在此之前，提高显微镜分辨率的方法主要是基于新物理原理或化学新探针的应用，而合作团队首次从计算的角度提出可用于突破光学衍射极限的通用算法理念，利用信号稀疏性和时空连续性这两个先验知识联合约束解卷积计算。其中，稀疏性约束恢复高频信息（朝向真实信号，即通过算法将测量信号向真实信号重建），同时这一图像重建过程也受到时空连续性的约束。需要指出的是，信号的时空连续性以及由高空间分辨率导致的荧光图像相对稀疏性，是荧光显微成像的两个通用先验知识，不依赖样本的形态以及特定的荧光显微镜种类，这是与当下热门的深度学习超分辨率显微重建方法的最大不同之处。得益于两个处于不同层面的先验约束协同完成信号恢复，稀疏解卷积远比只有单一约束的解卷积模型更加稳健和有效（见图1），能够有效鲁棒地突破现有光学显微系统的硬件限制，首次实现了荧光的计算超分辨率显微成像，而且运用该算法能够实现约2倍的分辨率提升。因此，稀疏解卷积是一种通用荧光显微计算超分辨率成像算法，可被广泛应用于提升其他荧光显微模态分辨率，观察不同种类细胞器的精细结构及动态（见图2）。
应用与实践
由稀疏解卷积算法与自主研发的超快超分辨率结构光显微镜系统结合得到的稀疏SIM（Sparse-SIM），能够实现目前活细胞光学成像方法中分辨率最高（60纳米）、速度最快（564赫兹）、成像时间最长（1小时以上）的活细胞超分辨率荧光显微成像。稀疏SIM在以低激发功率保证活细胞低光损伤的前提下，拥有比传统SIM更高的灵敏度和空间分辨率，将分辨率提高至光学衍射极限的4倍以上（SIM可将分辨率提高至光学衍射极限的2倍，再运用稀疏解卷积算法可使分辨率得到进一步提升）。通过滚动（Rolling）重建，在564赫兹的时间分辨率下，稀疏SIM能够识别出INS-1细胞中由VAMP2-pHluorin标记的、更小的胰岛素囊泡融合孔道（见图3）。这些孔道出现在囊泡融合过程的早期，孔径小（平均直径约87纳米），持续时间短（9.5毫秒），无法被传统的全内反射SIM（TIRF-SIM）识别，而稀疏SIM成功观测到了这一进程。值得一提的是，虽然这里发现的囊泡早期融合孔状态很难被其他的超分辨率成像手段直接验证，但其发生频率与20世纪80年代用快速冷冻蚀刻电子显微镜所观察到的“小的融合孔发生概率远低于大的融合孔”现象（参见文章“Beginning of Exocytosis Captured by Rapid-freezing of Limulus Amebocytes”）相吻合。由稀疏解卷积算法与商用的转盘共聚焦结构光显微镜（SD-SIM）结合得到的稀疏SD-SIM（Sparse SD-SIM），能够以优于90纳米的分辨率实现多色、三维、长时间的活细胞超分辨率荧光显微成像。合作团队使用双色稀疏SD-SIM在活细胞中观测到了内质网与溶酶体接触的事件。稀疏SD-SIM还可进行四色超分辨率成像，能够在活细胞中同时观测溶酶体、线粒体、微管和细胞核的动态图像（见图4）。类似地，合作团队在活体COS-7细胞的轴线上观察到细胞核、线粒体和微管的三维图像，并进行了三色成像，如图5（a）所示。经过稀疏解卷积优化后，微管成像点扩散函数（PSF）的轴向半高宽（FWHM）从465纳米降低到228纳米，如图5（b）所示。此外可以观察到，在一些轴向面被微管丝和线粒体侵入的区域，连续的、凸状的核结构向内弯曲变成凹状，如图5（c）所示。这种相互作用的变化表明微管蛋白网络可能会影响细胞核的组装和形态。
合作团队提出的稀疏解卷积算法是一种实现计算超分辨率荧光显微成像的全新方法，而与基于特定物理原理或特殊荧光探针的超分辨率方法都不相同。通过实际的生物样本实验量化，稀疏解卷积算法被证明能够实现接近2倍稳定的空间分辨率提升，而不需要付出额外的硬件代价。稀疏解卷积算法与超快超分辨率结构光显微镜系统结合形成的稀疏SIM，更是目前活细胞光学成像中有着最高分辨率、最快速度、最长成像时间的超分辨率光学显微成像手段，可用于观察活细胞中囊泡分泌孔道和新中间态，辨识线粒体内嵴及其动态过程，记录不同蛋白标记的核孔复合体与小窝蛋白环状结构的动态过程。此外，稀疏解卷积算法具备较好的通用性，可与现有多数商业荧光显微镜进行结合应用，有效提升其空间分辨率，从而使其能够观察到更清楚的精细结构及动态。
未来，合作团队将进一步开发相关软件、数据库和工程化硬件平台，同时开展相关成果的产业化推广工作，以期早日为神经生物学、发育生物学、细胞生物学、遗传生物学、移植生物学等研究及临床应用提供更为高效的活体影像工具。
本文刊登于IEEE Spectrum中文版《科技纵览》2022年6月刊。
赵唯淞：哈尔滨工业大学博士生。
赵士群：北京大学博士后。李柳菊：北京大学博士后。李浩宇：哈尔滨工业大学仪器科学与工程学院教授。陈良怡：北京大学未来技术学院教授。谭久彬：中国工程院院士，哈尔滨工业大学教授。毛珩：北京大学博士。单春燕：国家蛋白质科学中心博士。刘彦梅：华南师范大学研究员。宋保亮：中国科学院院士，武汉大学教授。陈兴：北京大学教授。丁宝全：国家纳米科学中心研究员。纪伟：中国科学院生物物理研究所研究员。赵唯淞、赵士群、李柳菊为共同第一作者。
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