荧光PCR检测试剂使用和分装的注意事项

PCR实验室是分子诊断的基础，也是进行PCR实验的必备场所。近些年，分子诊断行业快速发展，使得很多IVD从业者对PCR的认识又进入到了一个新的阶段，但是基于实验室的基本知识仍然是非常重要的一环。

PCR实验室的设计原则

原则上应当设置4个区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。

根据使用仪器的功能，区域可适当合并。使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并;

采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。

各区功能必备物品清单：01

试剂储存和准备区(1区)

功能：

贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。

必备物品：

2～8℃和-20℃以下冰箱。

混匀器。

微量加样器(覆盖0.2-1000µl)

02

标本制备区(2区)

功能：

核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。

必备物品：

2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。

高速离心机。

混匀器。

水浴箱或加热模块。

微量加样器(覆盖0.2-1000µl)。

生物安全柜。

03

扩增区(3区)

功能：

cDNA合成、DNA扩增及检测。

必备物品：

核酸扩增仪(或荧光定量PCR仪)

04

扩增产物分析区(4区)

功能：

扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。

必备物品：

杂交仪、电泳仪、测序仪等

微量加样器(覆盖0.2-1000µl)

通用物品(4个区都有可能需要)

可移动紫外灯(近工作台面)。

消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。

专用工作服和工作鞋(套)。

专用办公用品。

样本管架(2区)

防爆夹(2区)

PCR管架(2区、传递窗)

其他物品

PCR实验室工作基本原则

1.进入各工作区域应当严格按照单一方向进行

试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→ 扩增产物分析区。

2.各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。

3.不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。

4.实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

5.工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。工作区的实验台表面应当可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应当方便有效。

由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯(254nm波长)，在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射。当PCR扩增产物仅几百或几十碱基对(bp)，对紫外线损伤不敏感。

6.实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。

荧光PCR检测试剂盒是一种用于在PCR反应中检测特定DNA序列的试剂盒。这种试剂盒包括引物、荧光探针和缓冲液，它们的作用相互协同，实现PCR反应的同时进行荧光信号检测。

荧光PCR检测试剂盒使用步骤:

1.提取目标DNA:从待检测的样品(如血、组织等)中提取目标DNA,并加入PCR反应管中。

2. PCR反应体系准备:将PCR反应体系中所需要的检测试剂盒配制好，根据试剂盒说明书加入引物、荧光探针及缓冲液等试剂，并混合均匀。

3.反应条件设定:根据待扩增的DNA片段大小和设计的引物温度，设定PCR反应的温度程序和时间。

4. PCR反应进行:将PCR反应管放入PCR仪中，进行PCR反应。在PCR反应过程中， 引物将特异性地结合到目标DNA序列上，然后通过PCR循环反应不断扩增目标DNA。

5.荧光信号检测:随着PCR反应的进行，荧光探针与目标DNA序列杂交，产生荧光信号。荧光信号大小与PCR扩增产物数量成正比，可通过荧光定量PCR分析仪检测荧光信号大小，从而间

接获得PCR扩增产物的数量。

6.结果分析:根据样品是否出现荧光信号来判断目标DNA序列是否存在。如果出现荧光信号，则说明样品中存在目标DNA序列，反之则说明不存在。

荧光PCR检测试剂盒存储及使用注意事项：

1.储存温度:检测试剂盒应储存在干燥、阴凉、避光处，通常在-20°C以下保存。

2.搅拌均匀:使用前应将试剂盒中的各种试剂搅拌均匀，以避免试剂沉淀或结晶。

3.避免冻融:避免多次冻融使用，以免影响试剂盒的灵敏度和稳定性。

4.严格按说明书操作:使用检测试剂盒时，一定要严格按照说明书 上的步骤进行操作，避免操作失误导致结果偏差。

据国家卫健委官网数据显示11月15日0—24时，31个省(自治区、直辖市)和新疆生产建设兵团报告新增确诊病例1623例，截至11月15日24时，据31个省(自治区、直辖市)和新疆生产建设兵团报告，现有确诊病例15345例(其中重症病例29例)，我国疫情防控形势依然严峻。

检验人员是核酸检测工作的主力军，他们不但要保证检测结果的有效性，还时刻面临着被感染的风险。

本文为大家讲解《PCR实验室新冠核酸检测操作注意事项》，重点从新冠病毒生理特性、荧光PCR原理、PCR实验室筹备规范、样本检测环节操作、实验室数据分析、常见问题解析等几个方面讨论学习。

PCR实验原理

重复进行“变性 - 退火 - 延伸” 三个过程，模板DNA的量就会呈指数倍增加，理论上讲经过 n 个循环之后，模板量就会达到2的n次方。

常见问题解析

1、新冠试剂出现翘尾，怎么处理?

答：如果是个别单一通道翘尾，不管是FAM还是VIC通道，首先按照要求复查，复查建议重新采样。

如果不方便重新采样建议对原有样本进行重新提取核酸验证，如果复查阴性判读阴性，如果复查还是同一通道翘尾，就要对结果仔细审核。

一是要排除实验室污染，二是要对病人信息了解清楚，从临床症状及接触史排查，如果没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一家试剂来验证。

如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。

2、N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因吗，灵敏度哪个更高?是否会和其他冠状病毒片段重叠?

答：N基因跟1ab都是特异的，不会跟其他呼吸道病原体交叉反应。设计时候，两个基因的序列不一样，导致灵敏度不一样，N基因的灵敏度比1ab灵敏度高。

3、新冠检测结果和临床诊断不符合，怎么解读?

答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外检测结果也和取样，核酸提取以及样本本身的核酸浓度有关，需要逐一分析，同时可以结合临床症状判读。

4、采用生理盐水做阴性对照，内标也会增长，怎么解释?

答：因为试剂采用的是内源性内标，内源性内标是用人源基因标记，此基因存在于人的表皮细胞内，操作过程中就可能会出现人源性的污染，另外环境污染也有可能导致内标增长，这也是前面提到的建议做环境样本质控。

5、新冠样本内标不出如何处理?

答：如果新冠样本内标不出，该样本必须复查，可重新混匀该样本提取核酸，如果重新提取该样本内标还是不出，在排除提取问题的情况下，说明采样不合格，要通知临床重新采样复查。

6、采集环境样本检测新冠状病毒，为啥大部分样本内标不出，偶尔个别样本检测出内标?

答：因为新冠试剂检测的是人内源性内标，环境样本一般不含有人源细胞，所以检测不出内标;偶尔检出内标，可能该环境样本上有人源性细胞粘附，故而检出内标。